콜로니 PCR의 개념, 필요성, 실험 프로토콜, 프라이머 설계
분자생물학 실험을 하다 보면, 클로닝이 잘 되었는지 확인해야 하는 순간이 자주 찾아와요. 이럴 때 빠르고 간편하게 확인할 수 있는 방법이 바로 콜로니 PCR(Colony PCR)이에요. 플라스미드가 제대로 들어갔는지, 원하는 DNA 조각이 클로닝됐는지, 짧은 시간만에 확인할 수 있는 똑똑한 실험이죠.
그럼 콜로니 PCR은 어떤 방식으로 이뤄질까요?
콜로니 PCR이란?
콜로니 PCR은 이름 그대로, 배지 위에 자란 박테리아 콜로니를 직접 PCR 반응에 사용하는 실험이에요. 따로 DNA 추출을 하지 않고, 박테리아 세포를 그냥 PCR 반응에 넣어서 그 안에 있는 플라스미드나 유전체 DNA를 증폭시켜보는 거예요.
이 실험의 목적은 대부분 “내가 넣으려던 유전자가 플라스미드에 잘 들어갔는가?”를 확인하는 것이고요, 그래서 클로닝 확인용 PCR이라고도 불려요.
왜 굳이 콜로니 PCR을 하나요?
플라스미드를 넣은 세균 수십~수백 개가 배지에 자라게 되는데, 그중 일부만 클로닝이 제대로 되었을 수도 있어요.
그런데 이걸 전부 DNA 추출해서 확인하면 시간도 오래 걸리고, 힘도 들고, 비용도 많이 들죠.
그럴 때 콜로니 PCR을 하면 하루도 안 돼서 어떤 클론이 성공했는지 바로 골라낼 수 있어요.
이후 그 클론만 따로 키우면 되니까 실험의 효율이 훨씬 높아져요.
실험 순서는?
1) PCR mix 준비하기
일반 PCR과 동일하게, dNTP, 프라이머, Taq polymerase, 버퍼를 섞어서 준비해요.
주의할 점은 Taq 같은 일반 DNA polymerase를 사용하는 게 좋다는 거예요. 고충실도(high fidelity) 효소는 세포 찌꺼기에 민감해서 잘 작동하지 않을 수 있어요.
2) 콜로니 찍기
멸균된 팁이나 이쑤시개로 배지 위 콜로니를 톡 찍은 뒤, PCR 튜브 안에 휘휘 저어줘요.
(그 다음 같은 콜로니를 따로 LB 배지나 글리세롤에 보관해 두면, PCR 결과가 괜찮을 경우 바로 쓸 수 있어서 좋아요.)
3) PCR 반응 돌리기
일반 PCR과 똑같이 95도에서 변성, 55~60도에서 결합, 72도에서 신장 단계를 반복해요.
단, 첫 번째 95도 단계에서 세포 파쇄를 위해 5~10분 정도 더 길게 변성하는 경우가 많아요.
4) 전기영동으로 확인하기
PCR이 끝난 뒤에는 일반적인 아가로스 겔에서 전기영동해서, 원하는 사이즈의 밴드가 있는지 확인하면 돼요. 밴드가 예상 크기와 같다면, 클로닝이 잘 되었다는 뜻이에요!
프라이머는 어떻게 설계하나요?
프라이머는 실험 목적에 따라 다양하게 설계할 수 있어요. 예를 들어,
위 그림과 같이 벡터 내에 삽입한 인서트(insert) 부분이 증폭되도록 프라이머 쌍을 짤 수도 있고, 그 밖에 벡터의 백본(backbone) 부분에 프라이머가 붙게끔 할 수도 있어요. 마지막으로 인서트와 백본에 걸쳐서 프라이머를 잘 디자인 함으로써 정말 인서트가 원하는 방향으로 잘 들어가 있는지를 확인하는 방법도 있죠.
여기까지가 콜로니 PCR의 개요와 실험 순서예요.
다음 2편에서는 콜로니 PCR과 관련 실전에서 자주 겪는 문제와 해결 팁을 소개해드릴게요.