CRISPR로 Knock-in 셀라인을 만드는 방법 - 2편
1편에서 Knock-in 실험의 기본 원리와 구성요소들을 살펴봤어요. 그렇다면 이제 실제로 실험을 어떻게 진행하고, 성공적으로 삽입된 세포를 어떻게 골라낼 수 있는지도 함께 알아볼게요.
실험은 어떻게 진행하나요?
세포 준비와 트랜스펙션
먼저 실험에 사용할 세포를 건강하게 키워야 해요. 세포의 상태는 HDR 성공률에 큰 영향을 줘요. 세포가 너무 과밀하거나 건강하지 않으면 효율이 떨어질 수 있어요.
그다음, Cas9, gRNA, 그리고 donor DNA를 세포 안으로 넣는 트랜스펙션(transfection)을 진행해요. 실험에 따라 전기천공(electroporation), 리포펙션(lipofection), 혹은 바이럴 전달법을 사용할 수 있죠. 특히 RNP(단백질+gRNA 복합체) 형태로 전기천공하는 방식이 최근에 많이 쓰이고 있어요. 효율이 높고 off-target도 적은 편이에요.
세포 회복과 배양
트랜스펙션 후에는 세포를 스트레스로부터 회복시켜야 해요. 일반적으로는 항생제 없이 1~2일간 정상적인 배양조건에서 키우고, 이후 선택 과정을 시작해요. 이때 세포에 따라 성장이 느릴 수 있으니, 너무 조급해하지 말고 기다리는 게 중요해요.
Knock-in된 세포는 어떻게 선별하나요?
항생제 선택(marker-based selection)
삽입된 donor DNA 안에 항생제 내성 유전자를 포함시켰다면, 배양 배지에 해당 항생제를 넣어서 Knock-in된 세포만 살아남도록 할 수 있어요. 예를 들어 puromycin이나 neomycin 같은 항생제가 사용돼요.
하지만 항생제 마커가 항상 Knock-in 위치에 정확히 삽입된 건 아닐 수 있어서, 선택 후에도 반드시 확인 절차가 필요해요.
형광 단백질 기반 선택(fluorescent sorting)
형광 단백질을 함께 삽입하면, FACS(유세포분석기)를 이용해서 형광 신호를 가진 세포만 선택할 수 있어요. 이 방식은 항생제보다 세밀하게 조절할 수 있고, 살아 있는 세포를 그대로 분리할 수 있다는 장점이 있어요.
삽입이 성공했는지 어떻게 확인하나요?
PCR 분석
Knock-in이 일어난 위치를 기준으로 프라이머를 설계해서 경계 부위를 PCR로 증폭하면, 삽입이 제대로 되었는지 확인할 수 있어요. 일반적으로 한쪽 프라이머는 유전체 상의 서열, 다른 쪽은 삽입된 donor DNA 안쪽 서열에 걸쳐 있도록 설계해요.
시퀀싱
PCR만으로는 불충분할 수 있기 때문에, 증폭된 DNA를 Sanger 시퀀싱으로 확인하는 게 좋아요. 프레임이 정확히 맞았는지, 예기치 않은 변이가 없는지 등도 함께 확인할 수 있어요.
단백질 발현 확인
만약 리포터 단백질이나 태그를 삽입했다면, 웨스턴 블롯(Western blot)이나 형광 현미경 관찰을 통해 단백질 발현 여부도 확인할 수 있어요. 이걸 통해 단순 삽입뿐 아니라, 실제로 단백질이 제대로 발현되는지도 평가할 수 있어요.
그럼 클론은 언제 어떻게 확립하나요?
확인 절차까지 마친 후에는 단일 클론(single cell clone)을 분리해서 확립하는 단계로 넘어가요. 보통 희석 배양이나 FACS를 통해 하나의 세포에서 자란 클론을 얻고, 그 클론이 진짜 원하는 Knock-in을 가진 세포인지 다시 한번 확인해요.
Knock-in 실험은 시간이 오래 걸릴 수 있지만, 제대로만 진행되면 연구에서 아주 유용한 맞춤형 세포주를 확보할 수 있어요. 예를 들어 특정 유전자에 형광을 붙이거나, 질병 유전자를 교정하거나, 기능성 단백질을 발현하는 셀라인을 만들 수 있죠.
CRISPR를 이용한 Knock-in은 단순한 유전자 절단을 넘어, 정확하고 정밀한 유전자 편집 기술로 연구의 정밀도를 한 단계 끌어올려줘요. 실험 설계부터 전달, 선택, 검증, 클론 확립까지 차근차근 단계를 밟아가면 누구나 Knock-in 셀라인을 만들 수 있어요.
다음에 기회가 된다면, Knock-in 전략 실패 원인과 해결 팁, 혹은 복잡한 유전자 삽입(large insert knock-in) 전략도 소개해드릴게요.