CRISPR로 Knock-in 셀라인을 만드는 방법 - 1편

 

 

유전자 편집을 한다고 하면, 보통 어떤 유전자를 '깨뜨리는' 걸 떠올리는 분이 많아요. 하지만 실제 연구에서는 단순히 유전자를 없애는 것보다, 정확하게 어떤 유전자를 '삽입'하거나 '교정'하는 일이 더 중요한 경우도 많아요.

 

 

 이렇게 세포에 원하는 유전자를 넣어서 만드는 게 바로 Knock-in 셀라인이에요.

 

 

Knock-in은 어떻게 이뤄질까요?

 

 

CRISPR 시스템에서 Cas9 효소와 gRNA를 이용해 유전체의 특정 위치를 절단하고, 그 절단 부위에 우리가 원하는 유전자 조각을 HDR(homology-directed repair) 메커니즘을 통해 삽입하는 방식으로 Knock-in을 만들 수 있어요. 이때 HDR이 작동해야 원하는 DNA 조각이 유전체 안에 정확히 삽입되기 때문에, 이 과정을 잘 설계하는 게 정말 중요해요.

 

 

2025.04.05 - [전공자를 위한 생물학/유전자 치료] - [크리스퍼] 4편 : DNA의 정확한 교정을 가능하게 해주는 방법, HDR

[크리스퍼] 4편 : DNA의 정확한 교정을 가능하게 해주는 방법, HDR

 

위 포스트에서는 HDR에 대한 기본적인 개념이 나타나 있으므로 참고해주세요.

 

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Knock-in을 위한 실험 구성요소

 

gRNA 설계

gRNA는 Cas9이 정확한 위치를 자를 수 있도록 유도해주는 역할을 해요. 원하는 삽입 부위 근처에 있는 PAM 서열(NGG)을 찾고, 그 앞쪽 20nt 정도를 gRNA로 사용하면 돼요. gRNA는 삽입 위치에서 최대한 가까운 곳을 자르는 게 좋고, 너무 멀면 HDR 효율이 떨어져요.

 

Donor DNA (템플릿 DNA)

우리가 삽입하고 싶은 유전자 조각은 donor DNA 형태로 세포에 같이 넣어줘야 해요. 이 donor는 크게 두 가지 형태로 나뉘어요.

 

1) ssODN (단일 가닥 올리고) :  200nt 이내의 짧은 교정을 할 때 사용해요. 보통 상동 팔을 40~80nt 정도 붙여서 사용하죠.

2) dsDNA (이중 가닥 DNA) : 리포터 유전자, 항생제 내성 유전자처럼 더 큰 조각을 넣을 때 사용해요. 이 경우는 상동 팔을 각각 500~1000bp 정도로 설계하는 게 일반적이에요.

 

Cas9 전달 방식

Cas9은 단백질, mRNA, 또는 플라스미드 형태로 세포에 넣을 수 있어요. 최근에는 RNP(Cas9 단백질 + gRNA 복합체) 형태로 넣는 방법이 off-target 효과가 적고 HDR 효율도 좋다고 알려져 있어요. 특히 일시적인 발현만 일어나고 세포에 독성이 덜하기 때문에 많이 사용되고 있어요.

 

세포주기 고려

HDR은 S기와 G2기, 즉 DNA 복제가 일어나는 시점에서 가장 활발해요. 그래서 Knock-in 실험 전에 세포를 이 시기로 유도하거나, 세포 주기를 조절해서 HDR이 잘 일어나도록 도와주기도 해요.

 

 

삽입 위치는 어떻게 고르나요?

 

 

 

삽입 위치를 고를 때는 유전자 기능을 고려해야 해요. 예를 들어, 단백질 말단(C-말단)에 리포터를 붙이고 싶을 때는 정지코돈 바로 앞에 삽입하는 식으로 설계해요. 또는 특정 엑손 내에 삽입해서 기능을 조절하거나, 프롬터 앞에 삽입해서 발현 조절을 하기도 해요.

 

단, 프레임이 잘 맞는지, 삽입으로 인한 기능 변화는 없는지 등 설계 전에 유전체 구조와 단백질 도메인을 잘 확인해야 해요. 이 부분은 실험의 성패를 가를 수 있거든요.

 

 

여기까지가 Knock-in 셀라인 제작의 기본 개념과 핵심 요소들이에요. 다음 2편에서는 실험을 어떻게 진행하고, 성공적인 Knock-in 셀라인을 선택하고 검증하는 방법까지 자세히 소개해드릴게요.