[세포생물학] 1.2 : 단백질의 분석 - SDS-PAGE & 2D gel electrophoresis & etc
이번 포스트에서는 정제한 단백질을 분석(analyze)하는 방법에 대해 알아보도록 할게요.
본격적으로 시작하기에 앞서,
단백질을 분석할 수 있는 방법은 엄~~~~~~~~~청 많다는거를 아셔야 해요 ㅋㅋㅋㅋㅋ
그 중에서 아주 기본 중의 기본에 해당하는!
세포생물학을 배웠는데 이걸 모르면 욕먹을만한!
그런 몇 가지 방법들에 대해서만 알아보도록 할게요
사실 이 마저도 하나하나를 깊이있게 알아보려면 너무 많은 배경지식이 필요하기 때문에, 나중에 아예 실험기법들만 따로 모아서 포스트로 작성해보려고 계획하고 있어요. 그러니 본 포스트에서는 느낌 정도만 알아보는 걸로 하죠 ㅋㅋ
1. SDS-PAGE
첫 번째로 알아볼 녀석은 바로 SDS-PAGE에요.
보통 대학에서 생물학 실험 같은 과목을 수강하시게 되면 SDS-PAGE 실험을 한번씩은 다 해보실텐데요!
요 녀석은 간단히 말하자면 단백질 버전 전기영동이예요.
그럼 전기영동이 뭐냐! 하고 물으실 분들도 있으실까봐 설명하자면 ㅋㅋ
전기영동(electrophoresis)는 이름에 '전기'가 들어가있는 걸 보면 알 수 있는 것처럼 전기장을 사용해서 특정 물질을 분리해내는 기술이예요.
위 그림에 전기영동의 모식도가 나타나 있는데요.
한쪽 끝에 -극을, 나머지 한쪽 끝에 +극을 위치시킨 상태에서 그 사이에 sample을 로딩하고 달리게끔 만드는거예요.
그러면 gel 상에서 얼마나 달렸는지 정도를 가지고 sample 내부의 물질들을 크기에 따라 분리할 수 있어요.
자, 이 때 눈치빠른 분이시라면 알아차렸겠지만, sample 내부의 물질들은 반드시 전하를 띄고 있어야 해요.
전하가 없는 입자라면 양 끝에 아무리 센 전기장을 걸어주더라도 꿈쩍도 하지 않겠죠.
그러면 생체 물질들 중에 전하를 띄고 있는 대표적인 물질들이 뭐가 있을까요?
바로 핵산(DNA, RNA)과 단백질이죠.
그래서 핵산, 단백질을 분리하는데 전기영동이 사용될 수 있는거에요.
그 중 단백질을 분리하는 전기영동법이 SDS-PAGE인 것이죠.
그런데 여기서 SDS-PAGE를 수행하고자 할 때 문제가 있어요.
우리가 기본적으로 단백질 전기영동을 수행하고자 하는 이유는 단백질을 크기에 따라서 분리하기 위해서인데,
단백질마다 가지는 전하도 다 다르기 때문에, 결국 gel 상에서 달릴 떄 크기와 전하가 다 영향을 미치게 되는거죠...
이거 때문에 단백질이 가지고 있는 전하를 공통적으로 통일시켜줄 필요가 있어요.
요런 목적으로 사용되는 두 화합물이 바로 β-mercaptoethanol과 SDS인 거죠.
β-mercaptoethanol은 단백질의 이황화결합을 끊어줘서 단백질을 쭈욱 다 펴주는 녀석이에요.
즉, 구부정하게 접혀있는 단백질을 일직선으로 펴주는 거죠.
β-mercaptoethanol에 의해 단백질이 쭉 펴지게 되면 이 단백질의 표면에 SDS가 coating될 수 있어요.
그런데 이 SDS는 머리부분에 - 전하를 가지고 있어요.
결국 β-mercaptoethanol에 의해 쭉 펴진 단백질 전체가 음전하를 띄는 SDS로 뒤덮이게 되니까 모든 단백질들의 전하가 다 통일될 수 있는거죠.
요런 식으로 단백질들의 전하를 다 통일시켜주고 나면 이제 전처리 과정은 끝난 셈이에요.
그러면 이제 앞서 봤던 전기영동 그림처럼 양쪽에 전기장을 걸어준 상태에서 단백질을 로딩하고 달리게 만드는거죠.
그러면 위 그림에 나와있는 것과 같은 결과 data를 얻을 수 있어요.
참고로 SDS-PAGE의 이름은 SDS + PAGE의 합성어인데요.
SDS는 앞에서 단백질의 전하를 통일시키기 위해 사용했던 그 녀석 맞고요.
PAGE는 polyacylamide gel electrophoresis의 약자에요.
이 중 gel electrophoresis는 그냥 전기영동의 뜻이고 polyacyrlamide는 SDS-PAGE 시 주로 사용하는 gel의 한 종류에요.
이런거까지 세세하게 기억하면 머리아프니까! ㅋㅋㅋㅋ
그냥 SDS-PAGE는 단백질의 전하를 다 통일시킨다음에 크기순으로 단백질을 분리하는 방법이구나~~
정도만 기억해두셔도 충분할 것 같아요.
2. 2D gel electrophoresis
다음으로 알아볼 것은 2D gel electrophoresis인데요.
이 녀석도 이름에 electrophoersis(전기영동)이 들어가는 걸 보면 대충 감이 오시지 않으시나요?
이 녀석도 앞서 본 SDS-PAGE와 마찬가지로 전기영동의 일종인데요.
더 엄밀히 말하자면 업그레이드 버전의 SDS-PAGE에요.
앞서 살펴본 SDS-PAGE의 목적이 뭐였죠?
네 단백질을 크기별로 분리하는 거였죠!
이를 위해서 SDS를 이용해서 전하에 의한 차이를 다 상쇄시켜버려줬었죠..
근데 이렇게 SDS-PAGE를 사용하다 보니 크기가 겹치는 단백질들이 너~~~~무 많은 게 문제가 된거죠ㅜㅜ
그래서 단백질을 전하, 크기 두 요소에 대해 다 분리하고자 만들어진 것이 2D gel electrophoresis에요.
아니, 아까 SDS-PAGE에서는 전하 요소를 통일시켜준다고 하지 않았나요?
어떻게 전하, 크기를 둘 다 고려해줄 수 있죠? 그건 걍 SDS 안 쓴 전기영동이랑 다를 게 없지 않나요??
라고 묻는 분이 많으실 것 같은데요.
2D gel electrophoresis에서는 이 문제를 해결하기 위해서 '2D'로 전기영동을 수행해줘요.
위 그림에 2D gel electrophoresis의 모식도가 나타나 있어요.
보시면 우선 가로 방향으로 단백질을 전하별로 전기영동해서 분리시켜줘요. (1D gel electrophoresis)
단백질을 전하별로 분리시키기 위해서는 독특한 gel이 사용되는데요.
위 그림 1)에 나타나 있는 것처럼 gel 전반에 걸쳐서 pH가 다 다르게 세팅이 되어있어요.
왜 pH를 다르게 세팅해놓은 걸까요?
위 그림에는 단백질을 이루고 있는 아미노산의 구조가 나타나 있는데요.
우리가 익숙히 알고 있는 아미노산의 모습은 왼쪽과 같지만,
사실 pH에 따라서 amino group와 carboxyl group은 위 그림 오른쪽과 같이 전하를 가진 채로 존재할 수 있어요.
그리고 위 그림에서는 나타나 있지 않지만 R기의 경우에도 pH에 따라 각기 다른 전하를 가질 수 있어요.
그렇다 보니 단백질의 종류에 따라서 똑같은 pH에서도 서로 다른 전하를 가질 수 있게 되는거죠.
그런데 단백질의 종류에 따라서 각각 자신의 전하가 0이 되는 pH인 isoelectric point가 존재할 수 밖에 없어요.
이걸 이용한게 1D gel electrophoresis인거죠.
이제 방금 설명한 내용을 바탕으로 다시 1D gel electrophoresis 모식도를 살펴볼게요.
위 그림과 같이 gel 상에 pH gradient가 쭉 형성되어 있으면
단백질은 각기 다른 isoelectric point 하에서 전하가 0이 되겠죠?
그런데 결국 전하가 0이 되었다는 말은 뭐죠?
아무리 전기장이 강하다 하더라도 전기력을 전혀 받지 않는다는 말이겠죠?
그래서 결국에는 단백질들이 각기 다른 isoelectric point 상에서 멈춰있게 되는거죠.
아무튼 이런 방법을 이용하면 단백질을 전하에 따라서 분리할 수 있어요.
그러고 나서 이렇게 분리된 가로 방향으로 긴 gel을 위 그림에 나타난 것처럼 세로축으로 기다란 넓은 gel 맨 위쪽에 착 붙여줘요.
앞서 1D gel electrophoresis를 통해서 이미 단백질을 전하에 따라 분리해줬기 때문에
이 시점에서는 전하에 대한 영향을 고려해줄 필요가 없겠죠?
그래서 앞서와 마찬가지로 SDS를 이용해서 전하를 통일시켜준 상태에서 SDS-PAGE를 이용해 단백질을 크기별로 분리시켜주게 돼요.
내용이 조금 복잡한 것 같아서 다시 정리를 해 볼게요.
1. 1D 방향으로 단백질을 전하에 따라 분리해준다.
2. 이렇게 분리된 1D gel을 SDS-PAGE 시 이용하는 gel에 붙여준다.
3. SDS를 이용해 전하 효과를 없앤 뒤에 단백질을 크기에 따라서 SDS-PAGE로 분리해준다.
이 때 핵심은 단백질을 전하, 크기에 따라서 분리할 수 있다는 거죠.
위 그림에는 2D gel electrophoresis 결과 예시가 나타나 있으므로 참고하지면 좋을 것 같아요.
3. 그 외...
이번 포스트에서는 SDS-PAGE, 2D electrophoresis에 대해 중점적으로 살펴봤어요.
그렇다고 해서 단백질을 분리, 분석할 수 있는 방법이 이것만 있다고 생각하시면 절대 안된다는 걸 기억해두세요 ㅋㅋㅋ
예를 들어 단백질의 질량을 측정하기 위해서는 질량분석기(mass spectrometry, MS)와 같은 방법이 사용될 수 있고,
단백질의 구조를 결정하기 위해서는 X-ray crystallography, NMR, Cryo-EM과 같은 방법들이 사용될 수 있어요.
이런 기술들에 대해서도 본 포스트에서 설명할 수 있었으면 좋았겠지만,
이 기술들을 제대로 이해하기 위해서는 생물물리학적인 기반지식이 조금은 필요하기 때문에...ㅎㅎ
본 포스트에서는 그렇게 자세히 다루지 않았어요.
이번 포스트에서는 SDS-PAGE, 2D electrophoresis와 같은 단백질의 분석 방법에 대해 알아봤어요.
다음 포스트부터는 세포를 관찰할 때 가장 많이 사용되는 장비 중 하나인 현미경(microscope)에 대해서 알아보도록 할게요!