[오토파지] 4편 : 오토파지 실험 결과 해석하기 - Bafilomycin A1, Chloroquine, GFP-LC3

 

 

오토파지 연구를 처음 접하면 가장 헷갈리는 부분이 실험 결과 해석이에요.

Western blot에서 LC3-II가 증가했는데 논문에서는 오토파지가 활성화되었다고 말하기도 하고, 다른 논문에서는 오히려 오토파지가 막혔다고 설명하기도 하거든요.

 

 

같은 LC3-II 증가인데 왜 해석이 달라질까요?

이 질문에 답하기 위해 등장한 개념이 바로 Autophagic Flux예요.

최근 오토파지 연구에서는 LC3나 p62 자체보다 Flux를 확인하는 것이 훨씬 중요하게 여겨지고 있어요.

이번 글에서는 오토파지 연구에서 가장 많이 사용하는 실험 방법들과 결과 해석 방법을 정리해보려고 해요.

 

왜 LC3-II만 보면 안 될까?

오토파고좀은 계속 만들어지고 분해되는 구조예요.

세포 안에서 오토파고좀이 생성된 뒤 리소좀과 융합하고, 내부 내용물이 분해되면서 사라져요.

문제는 LC3-II 증가가 여러 상황에서 나타날 수 있다는 점이에요.

첫 번째는 오토파고좀 생성이 증가한 경우예요.

두 번째는 오토파고좀이 분해되지 못하고 축적된 경우예요.

둘 다 최종적으로 LC3-II 증가라는 결과를 만들 수 있어요.

그래서 LC3-II만 보고는

"오토파지가 활성화되었다"

라고 결론 내릴 수 없어요.

실제로 많은 저널에서 LC3 blot 하나만 가지고 오토파지를 주장하는 것을 인정하지 않아요.

 

Autophagic Flux란 무엇일까?

Autophagic Flux는 오토파지 전체 흐름을 의미해요.

오토파고좀 생성
리소좀 융합
내용물 분해
재활용

까지 전 과정이 정상적으로 진행되는지를 보는 개념이에요.

쉽게 말하면 고속도로 교통량을 생각하면 돼요.

도로 위 차량 숫자만 보고 교통량을 판단할 수는 없어요.

차량이 많이 들어와서 많을 수도 있고, 정체가 생겨서 쌓인 것일 수도 있거든요.

 

오토파고좀도 마찬가지예요.

많이 생성된 것인지, 아니면 분해되지 못하고 정체된 것인지 구분해야 해요.

그래서 Flux 분석이 필요한 거예요.

 

Bafilomycin A1은 왜 사용할까?

 

 

 

오토파지 논문에서 가장 자주 등장하는 약물 중 하나가 Bafilomycin A1이에요.

보통 줄여서 BafA1이라고 부르죠.

이 약물은 리소좀 내부 산성화를 억제해요.

결과적으로 리소좀의 분해 기능이 차단돼요.

즉 오토파고좀은 만들어지지만 최종 분해는 일어나지 않게 돼요.

이 특성을 이용해서 Flux를 측정해요.

예를 들어 어떤 약물을 처리했더니 LC3-II가 증가했다고 해볼게요.

여기에 Bafilomycin A1을 추가했더니 LC3-II가 더 크게 증가한다면?

오토파고좀이 계속 만들어지고 있었는데 원래는 분해되고 있었던 상황으로 해석할 수 있어요.

반대로 Bafilomycin A1을 처리해도 LC3-II 변화가 거의 없다면 이미 분해 단계가 막혀 있었을 가능성을 생각하게 돼요.

 

Chloroquine도 비슷한 역할을 해요

 

 

Chloroquine 역시 오토파지 연구에서 자주 사용되는 약물이에요.

말라리아 치료제로 유명하지만 실험실에서는 오토파지 억제제로 훨씬 많이 사용돼요.

원리는 약간 달라요.

Chloroquine은 리소좀 내부 pH를 증가시켜 분해 효소 활성을 떨어뜨려요.

결과적으로 리소좀 기능이 억제돼요.

실험 결과는 Bafilomycin A1과 비슷하게 나타나는 경우가 많아요.

그래서 Flux 분석이나 오토파지 억제 실험에 자주 사용돼요.

실제로 암 연구 논문에서는 Chloroquine을 항암제와 병용하는 연구도 많이 볼 수 있어요.

 

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GFP-LC3 puncta는 무엇을 의미할까?

 

 

형광현미경 Figure를 보면 초록색 점들이 세포 안에 찍혀 있는 이미지를 자주 볼 수 있어요.

이게 바로 GFP-LC3 puncta예요.

LC3는 원래 세포질 전체에 퍼져 있어요.

오토파고좀이 형성되면 LC3-II가 막에 결합하면서 특정 위치에 집중돼요.

현미경에서는 점 형태로 보이게 되죠.

그래서 puncta 수가 증가하면 오토파고좀이 많이 형성되고 있다는 의미로 해석할 수 있어요.

다만 여기서도 같은 문제가 발생해요.

오토파고좀 생성 증가인지,

분해 장애에 의한 축적인지,

구분하기 어려워요.

그래서 최근 연구에서는 GFP-LC3만 사용하는 경우가 줄어들고 있어요.

 

mCherry-GFP-LC3 Reporter는 왜 등장했을까?

이 문제를 해결하기 위해 개발된 것이 mCherry-GFP-LC3 reporter예요.

원리는 생각보다 간단해요.

GFP는 산성 환경에서 형광이 약해져요.

반면 mCherry는 산성 환경에서도 비교적 안정적으로 유지돼요.

오토파고좀이 형성된 상태에서는

GFP 신호
mCherry 신호

둘 다 보여요.

그래서 노란색 점으로 보이게 돼요.

리소좀과 융합하면 내부 환경이 산성화돼요.

이때 GFP는 사라지고 mCherry만 남아요.

결과적으로 빨간색 점만 관찰돼요.

즉

노란색 = 오토파고좀

빨간색 = 오토리소좀

으로 구분할 수 있는 거예요.

현재 오토파지 Flux 분석에서 가장 널리 사용되는 방법 중 하나예요.

 

논문에서 가장 많이 보는 조합

최근 오토파지 논문을 보면 보통 다음과 같은 데이터를 함께 제시해요.

LC3 Western blot

p62 Western blot

Bafilomycin A1 처리

mCherry-GFP-LC3 reporter

TEM(Transmission Electron Microscopy)

이 정도 조합이면 오토파지 활성 여부를 상당히 신뢰성 있게 평가할 수 있어요.

반대로 LC3 blot 하나만 제시하는 경우에는 결과 해석에 주의가 필요해요.

오토파지 연구에서는 단일 마커보다 여러 결과를 함께 보는 것이 기본 원칙에 가까워요.



오토파지 연구에서 가장 중요한 개념은 Autophagic Flux예요. LC3-II 증가나 GFP-LC3 puncta 증가만으로는 오토파지 활성 여부를 판단하기 어려워요. 오토파고좀이 많이 만들어진 것인지, 아니면 분해되지 못하고 쌓인 것인지 구분해야 하기 때문이에요.

그래서 Bafilomycin A1, Chloroquine, mCherry-GFP-LC3 reporter 같은 도구들이 개발됐고, 현재는 이러한 방법들을 조합해서 오토파지 전체 흐름을 분석하는 것이 표준적인 접근법으로 자리 잡고 있어요.

다음 편에서는 오토파지와 암의 관계를 다뤄볼게요. 종양 억제 기전으로 알려졌던 오토파지가 왜 어떤 암에서는 오히려 암세포 생존을 돕는지, 그리고 항암제 연구에서 왜 오토파지 억제제가 등장하는지 정리해보려고 해요.